Sıçanlarda Parsiyel Hepatektomi sonrası karaciğer Reğernerasyonunda Gallik Asit Etkısının PI13/AKT/mTOR Yolağı Üzerinden Belirlenmesi.
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Eskişehir Osmangazi Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Moleküler Biyoloji Bilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: NEDA HAMID
Danışman: Mediha Canbek
Özet:
Karaciğer kendini yenileme ve onarma yeteneğine sahip eşsiz bir organdır. Hasar
gördüğünde tam çalışma kütlesine ulaşmak için çoğalmaya başlar. Kısmi hepatektomiden
sonra, karaciğer ayrıca hücre replikasyonunu ve gelişimini moleküler mekanızmalarını
kullanarak aktive eder.
Hepatosit genişlemesi; büyüme hormonları, hücre içi aracılar (EGF, HGF, TGF-, IL-
6, vb.) ve moleküler mekanizmalar tarafından indüklenir. PI3K/AKT/mTOR karaciğer
rejenerasyonunda rol oynayan çok önemli bir moleküler yolaktır. %70 parsiyel
hepatektomiden sonra PI3K/AKT/mTOR yolu aktive olarak hepatosit sayısının normale
dönmesini sağlar.
Karaciğerin yenilenme yeteneğini değiştiren yeni farmakolojik ürünler ile karaciğer
fonksiyon bozukluğu ile mücadele edilebilir. Oksidatif strese ve serbest radikallere karşı,
polifenollerin karaciğeri korumada etkili olduğu kanıtlanmıştır. Birkaç fenolik asit arasında
Gallik asit antioksidan özellikleri ile öne çıkmıştır. Kapsamlı araştırmalara rağmen, bu
maddenin potansiyel karaciğer yenileyici etkisi ve mekanizması henüz bilinmemektedir.
Bu amaçla çalışmamızda Gallik asitin sıçanlarda (Erkek Wistar albino) rejeneratif
etkisine bakıldı. Ayrıca rejeneratif etkisi kanıtlanmış Silmarin maddesi de pozitif kontrol
olarak çalışmamızda yer aldı. Deney gruplarımız 4 ana grup ve 13 alt gruptan (n=6) oluştu.
Grup I (kontrol), Grup II (PHx+SF), Grup III (PHx+silmarin100 mg.kg-1i.p), Grup IV
(PHx+gallik asit 200 mg.kg-1i.p). Daha sonra %70 PHx gerçekleştirildi. Deney hayvanları
6, 12, 24, 48 saatlik sürelere kadar yaşatıldı. Deney sonunda PI3K/AKT/mTOR yolağına ait
6 gen ekspresyonu RT-PCR ile incelendi. Daha sonra PI3K/AKT/mTOR yolağına ait en
etkin olan genler seçilerek protein analizleri western blot ile değerlendirildi. PCNA
immunohistokimya analizleri yapılarak hücre proliferasyonuna bakıldı. Son olarakta
karaciğer hasarının belirteci olan ALT ve AST değerlerinin ölçümleri yapılarak
karşılaştırıldı.
vii
Çalışmamız sonucunda PIKCA gen ekspresyonuna baktığımızda SF (II) 6 saat ve
SLY (III) 6, 24, 48 saat ve GA (IV) 6, 12, 24, 48 saatleri arasında anlamlı fark (****,
P<0.0001, *** P0.0004, *** P0.0002, ** P0.0038, ****P<0.0001, ***P0.0004,
****P<0.0001) bulundu. Protein ifadesinde ise grublar arasında (****<0.0001) olarak fark
bulundu.
AKT1 gen ekspresyonunu ise Kontrol ve deney grupları arasında SF (II) 6, 12, 24,
48. saat, SLY(III) 6, 12, 24, 48.saat ve GA (IV) 6, 12, 24, 48 saatlerinde büyük ölçüde farklı
p değeri (****, 0,0001) olduğunu gözlemlendi. AKT1 protein ekspresyonu SF (II) 12 ve
GA (IV) 12 saat arasında (*P0.019, ***P0.0003) anlamlı bir fark tespit edildi.
mTORC1 gen ekspresyonunun SF (II), SLY(III) ve GA (IV) tüm grupları arasında
önemli ölçüde farklı (****P0.0001) olduğu ortaya çıktı. SF (II) 12 saat SLY (III) ve GA (IV)
24, 48 saat sonra protein ekspresyonunu gösteren western blot üzerinde net bir bant ölçüldü.
Siklin D1 gen expresyonunda SF (II) 6, 12, 24, 48 saat ve GA (IV) 24 saat arasında
istatistiksel olarak (**P0.0063, ****P0.0001, *P0.0144, ****P0.0001, *P0.0115,
****P0.0001) anlamlı bir fark ölçüldü. Ayrıca gruplar arasında SLY (III) 6, 12, 24, 48 saat
ve GA (IV) 6, 24 saat (*P0.0133, ****P 0,0001, *P0.015, ****P0,0001, *P0,0166,
****P0,0001, ***P 0,0003) fark bulundu. GA (IV) 12 ile 24 saat ve GA (IV) 24 ile 48 saat
arasında istatistiksel olarak anlamlı fark (**P0.0098, ***P0.0005) belirlendi. Aynı zamanda
SF (II) 48 ile SLY (III) 48 ve GA (IV) 48 saatleri arasında CyclinD1 protein ekspresyon
seviyeleri karşılaştırmasında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu
(****P0.0001, * P0.0252). Bulgularımıza göre, Siklin D1 geninin ifade miktarı nispeten
yüksek ölçüldü. Bunun nedenini Siklin D1 ve Siklin D ailesinin diğer türleri, hücre büyüme
sürecine katkıda bulunmak için birlikte işlev görmesine bağlayabiliriz. Bu nedenle
PI3K/AKT/mTOR yolağında yer alan farklı tipte siklin D tipi proteinlerinin görev aldığını
düşünmekteyiz.
Çalışmamızda Gallik asitin sıçanlarda %70 parsiyel hepatektomi sonrası 200 mg.kg-
1 i.p. dozunun ilk kez keşfedilen yenileyici faydaları çalışmamızda ortaya kondu. Sonuç
olarak tüm gruplarda Gallik asit PI3K/AKT/mTOR yolağını kullanarak hücre büyümesini
ve proliferasyonu arttırdığını verilerimizle ortaya kondu. Ancak bu yola ait Cyclin D1'i
viii
aktive eden transkripsiyon faktörü S6K701 geni ifade edilmedi. Buda bize Cyclin D1'in
aktivasyonunun üçüncü bir bileşenden kaynaklanabileceğini düşündürdü. Ayrıca
araştırmamızda ilk defa PIKCA(ser317) protein ekspresyonu kullanılmış ve tüm grupların
protein ekspresyonunun yanı sıra gen düzeylerinin de yüksek olduğu saptanmıştır.
ALT ve AST düzeyleri ise Gallik asit gruplarında 48. saatte diğer gruplara göre en
düşük olarak kaydedildi. Bu bize karaciğeri koruma yeteneklerini de göstermiş oldu. PCNA
değerlendirmesinde ise rejeneratif etkinin tüm gruplarda 48. saatte en yüksek olduğu
görüldü. Bazı hücrelerde yoğun boyanma bazılarında ise daha zayıf boyama tespit edildi.
Bazı hücrelerin ise mega hücreler oluşturduğunu veya çift çekirdekli hücrelere füzyon
yaptığı görüntülendi.
Sonuç olarak çalışmamızda Gallik asit karaciğer rejenerasyonuna etkisi
PI3K/AKT/mTOR moleküler yolağı ile tanımlanmış ve hepatosit hücrelerinin
proliferasyonunu arttırdığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gallik asid (200 mg.kg-1i.p) dozunun
rejeneratif etkisi bilinen Silmarin göre daha etkin proliferatif etki gösterdiğini söyleyebiliriz.