Polihidroksibütirat üretimi için entegre multi-omik, mekanistik makina ögrenmesive CRISPR yaklaşımı
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Eskişehir Osmangazi Üniversitesi, FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ, Biyoteknoloji ve Biyogüvenlik, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2022
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: BLAISE MANGA ENUH
Danışman: Pınar Aytar Çelik
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Halofilik organizmalar, yüksek değerli biyotemelli ürünler üretebilme yetenekleri nedeniyle ilgi çekmektedirler. Ekstremofiller, endüstriyel biyoreaktörlerde aşırı koşullara dayanabilirler ve bu da kontaminasyona çok daha az maruz kalmasını sağlar. Bu yüksek katma değerli ürünler arasında enzimler, polihidroksialkanotlar (PHAs), ektoin, vanilik asit gibi ürünler bulunmaktadır. PHAs, besinin sınırlandırıldığı koşullar altında depo polimeri olarak sentezlenirken, ektoin gibi osmoprotektanlar ise yüksek tuzluluk koşullarına cevaben üretilirler ve tuz stresine karşı koruma sağlarlar. Genom ölçekli metabolik modelleme (GEM) çalışmalarının uygulamaları çeşitlidir ve araştırmacılar, biyolojik sistemleri çalışmak için çok sayıda yenilikçi yöntem uygularlar. Özellikle, GEM'lerin kısıt tabanlı analizi, organizmaların genotip-fenotip ilişkilerini araştırmak ve istenilen bir işlevi değiştirmek için hipotez yönlendirilmiş metabolizma mühendisliği yapmak için kullanılabilir. Günümüzde, metabolik yolakların ve gen silme etkilerinin tahmin edilmesine olanak tanıyan GEM içinde aynı zamanda gen amplifikasyonlarının kullanıldığı endüstriyel suş geliştirmede kullanılabilecek sayısal algoritmalar mevcuttur. Bu çalışmanın amacı, genomik yöntemler ve manuel derlenmiş GEM kullanılarak Halomonas elongata'da polihidroksibütirat (PHB) üretimini deneysel olarak analiz etmektir. Bu, PHB verimini artırmak için metabolik mühendislik stratejilerini araştırmayı mümkün kılacaktır. Bu çalışmada, poli hidroksibutirat üretimi ve miktarını ölçmek için model organizma olarak Halomonas elongata suşu 153B kullanılmıştır. Bu bakterinin tüm genomu dizilenmiş, yapılandırılmış ve açıklanmıştır. İleri analizler, ortolog grupların kümeleri ve BLAST ile yorumlanan genlerin fonksiyonlarını keşfetmeye yardımcı olmuştur. Genomun içeriğinde; iyon taşıma, osmoregülasyon, oksidatif stres ile ilgili genler ile poli hidroksibutiratlar, sekonder metabolit kümeleri ve ksenobiotiklerin parçalanması için özelleşmiş genler bulunmaktaydı. Karşılaştırmalı genomik bir yaklaşım kullanılarak, Halomonas elongata suşu 153B'nin genomu ayrıca diğer 5 Halomonas suşu ve 7 türü ile de karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma için kullanılan Halomonas elongata suşları HEK1, HAL363, BLLS135 ve MH25661 iken, referans genom DSM 2581 idi. Karşılaştırmaya dahil edilen diğer türler ise Halomonas caseinilytica, Halomonas. socia, Halomonas organivorans, Halomonas boliviensis, Halomonas zincidurans, Halomonas lutea ve Halomonas malpeensis idi. Annot edilmiş genom, Halomonas elongata ve bazı durumlarda yakın türe ait veriler kullanılarak literatür verileriyle sıkı bir şekilde manuel düzenlenmiş, standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir GEM oluşturmak için kullanılmıştır. Model, büyümeyi, karbon kaynağı kullanımını ve osmoadaptasyon fenotipini, esansiyel genleri ve PHB, ektoin ve vanilik asit biyoproduktlarının üretim dinamiklerini taklit etmek için flux denge analiziyle analiz edilmiştir. CRISPR Cas benzeri gen silme çalışmalarının sonucu olarak ortaya çıkan fenotipik değişikliklerin nasıl PHB'nin biyosentezine etkilediği de araştırılmıştır. H. elongata 153B'nin genel genom özellikleri ve birçok biyosistem için genleri, işlevleri ve yolakları dahil olmak üzere ayrıntılı bir şekilde açıklandı. H. elongata 153B, diğer 4 rapor edilen türe ve referans türe göre değerlendirildiğinde H. elongata DSM 2581'e daha benzer özelliklere sahip olduğu görülmüştür. Ayrıca, H. elongata 153B suşunda yüksek osmolarite gösteren ortamlarda adaptasyon için önemli olan taşıma, osmoregülasyon, sinyalizasyon ve oksidatif stres ile ilgili birçok gen tespit edilmiştir. Bu genlerin bir koordine akış işbirliği ile adaptasyona yardımcı olduğu görülmüştür. H. elongata 153B'nin genomunun, ayrıca PHA, çeşitli vitaminler, ektoin, aromatik ve ilaç bileşiklerinin üretimine ilişkin genleri de içerdiği tespit edilmiştir. GEM, büyük bir manuel kurgulama ve doğrulama işlemi sonrasında yeniden inşa edilmiştir. Modelin, iEB1239, sitosol, periplazm ve ekstrasellüler boşluk adında üç bölmeye sahip olduğu görülmüştür. İlk taslak modelinde 1534 metabolik maddenin, 2314 reaksiyonun ve 1239 genin olduğu görülmüştür. Modelin MEMOTE standartlaştırma skoru %71 olarak bulunmuştur. Bu model, kurulmuş minimal ortam ve biyomas reaksiyonu kullanılarak, H. elongata biyokimyasal ve osmoadaptasyon fenotip özelliklerini doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağmamış ve ayrıca önceden test edilmiş ve test edilmemiş kaynaklar dahil 28 çeşit karbon kaynağında büyüme göstereceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, GEM, osmoregülasyonun inceliklerini doğru bir şekilde modelleme yeteneğine de sahip olduğundan PHB, ektoin ve vanillik asit üretiminin dinamiklerini de gösterebilmiştir. Bu çalışmada elde edilen bilginin, halofilik genom, metabolizma ve fizyolojisini anlama, değerli enzimler elde etme ve biyoteknolojik araştırmalar için hızlılaştırma amacıyla güvenilir bir bilgi kaynağı olarak hizmet vereceği düşünülmektedir. Bunun yanı sıra, geniş ölçüde doğrulanmış GEM, CRISPR Cas mühendisliği ile PHB ve diğer biyoteknolojik ürünlerin verimini artırmak, ayrıca halofilik metabolik süreçlerde henüz keşfedilememiş mekanizmaları araştırmak amacıyla kullanılabilecek bir sistem olması açısından biyolojik bir platform sağlamaktadır.